Bioimpresión 3D utilizando una nueva fotografía

npj Medicina Regenerativa volumen 8, Número de artículo: 18 (2023) Citar este artículo

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La bioimpresión tridimensional (3D) es una técnica muy eficaz para fabricar construcciones cargadas de células en ingeniería de tejidos. Sin embargo, la versatilidad de fabricar hidrogeles cargados de células complejos y precisos está limitada debido a la escasa capacidad de reticulación de los hidrogeles que contienen células. Aquí, proponemos un proceso de bioimpresión asistida por fibra óptica (OAB) para reticular eficientemente hidrogeles metacrilados. Al seleccionar las condiciones de procesamiento apropiadas para la técnica de fotoentrecruzamiento, fabricamos estructuras cargadas de células biofuncionales que incluyen gelatina metacrilada (Gelma), colágeno y matriz extracelular descelularizada. Para aplicar el método a la regeneración del músculo esquelético, se procesaron construcciones de Gelma cargadas de células con una boquilla funcional que tenía una señal topográfica y un proceso OAB que podría inducir una alineación uniaxial de C2C12 y células madre adiposas humanas (hASC). Se observaron grados significativamente mayores de alineación celular y actividades miogénicas en la estructura Gelma cargada de células en comparación con las de la construcción celular que se imprimió utilizando un método de reticulación convencional. Además, se observó un potencial regenerativo in vivo en defectos musculares volumétricos en un modelo de ratón. La construcción cargada de hASC indujo significativamente una mayor regeneración muscular que la construcción celular sin señales topográficas. Según los resultados, el proceso de bioimpresión recientemente diseñado puede resultar muy eficaz en la fabricación de construcciones cargadas de células biofuncionales para diversas aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Recientemente, se han fabricado andamios cargados de células que imitan estructuras de tejido complejas naturales utilizando una variedad de métodos ascendentes, como procesos electrohidrodinámicos, microfluídicos, fotolitográficos o litográficos blandos y de bioimpresión tridimensional (3D)1,2,3. 4,5. Debido a la capacidad de producción eficiente demostrada por las técnicas multicapa, el proceso de bioimpresión 3D se ha adoptado ampliamente en aplicaciones de ingeniería de tejidos. En particular, se han explorado significativamente las aplicaciones versátiles de diversas biotintas6,7,8,9.

Anteriormente, se han obtenido muchos resultados prometedores en el desarrollo de músculo esquelético mediante ingeniería tisular con funcionalidades mejoradas sin bioimpresión10,11. Sin embargo, una desventaja notable de las construcciones de músculo esquelético diseñadas con tejidos sin bioimpresión es la insuficiencia para fabricar geometrías específicas del paciente. Para superar este problema, se deben considerar varios parámetros, incluida la temperatura de impresión, la presión neumática, la velocidad de impresión y el proceso de reticulación para fabricar construcciones celulares 3D con actividades biológicas apropiadas, como una alta viabilidad/proliferación celular y diferenciación/maduración fenotípica de las células impresas. .

Sin embargo, los procesos de extrusión basados en boquillas demuestran varias deficiencias, como la resolución limitada del tamaño de los puntales, la densidad celular restringida de los puntales cargados con células y la baja capacidad de impresión, que resultaron de la naturaleza mecánica débil de los hidrogeles de carga celular. Se han introducido varias biotintas avanzadas conjugadas con iones para obtener construcciones celulares; sin embargo, la fabricación de estructuras cargadas de células mecánicamente estables utilizando la tecnología de impresión 3D sigue siendo un desafío a superar en la técnica de impresión y el proceso de formación de biotinta8,12,13.

Recientemente, para superar las deficiencias de los puntales cargados de células obtenidos mediante un proceso de impresión 3D, se han propuesto varias estrategias de reticulación, incluidos procesos de foto-reticulación in situ combinados con impresión8,14,15. Por ejemplo, la fabricación de filamentos cargados de células a microescala mecánicamente estables requiere procesos de impresión que empleen un sistema de boquillas de núcleo/cubierta, en el que la biotinta de alginato en la región de la cubierta se reticula inmediatamente con una solución de cloruro de calcio que protege la gelatina metacrilada cargada de células fotorreticulada. (Gelma) en el núcleo16,17. Además, estudios similares han fabricado fibras de núcleo (Gelma)/cubierta (alginato de sodio) cargadas de células utilizando un canal de microfluidos en el que se diseña Gelma cargado de células endoteliales en el núcleo18. Además, se ha introducido un método de reticulación in situ que utiliza una boquilla coaxial capilar transparente conectada a una impresora 3D para obtener estructuras impresas estables (retículas a microescala y tubos huecos) sin depender de la viscosidad de la biotinta8.

Los procesos de impresión propuestos han demostrado claramente resultados avanzados en la obtención de estructuras microfibrosas 3D cargadas de células que imitan las morfologías y biofunciones intrínsecas de los tejidos fibrosos reales; sin embargo, los métodos emplean biotinta limitada (es decir, uso de alginato de reticulación rápida en iones de calcio) para soportar materiales bioactivos cargados de células. Además, para los sistemas foto-reticulables in situ, no se puede obtener fácilmente una estructura 3D multicapa realista debido a la región de la cubierta apenas foto-reticulada de los hidrogeles cargados de células metacriladas que fluyen, y se requiere una boquilla específicamente transparente e hidrofóbica.

Para abordar estos desafíos encontrados por los sistemas de impresión anteriores, presentamos una nueva estrategia de foto-reticulación combinada con un proceso de impresión para fabricar estructuras mecánicamente estables y estructuras realistas cargadas de células multicapa. Con ese fin, utilizamos una fibra óptica incrustada dentro de una boquilla de impresión general para fotorreticular de manera estable hidrogeles metacrilados que fluyen (gelatina metacrilada, colágeno y matriz extracelular descelularizada (dECM)). Utilizando este sistema de reticulación único, se fabricaron de manera efectiva puntales cargados de células mecánicamente estables y biológicamente seguros y una estructura 3D cargada de células multicapa construida con una fuerza adhesiva razonable entre los filamentos cargados de células. Para aplicar la versatilidad del proceso de fotoentrecruzamiento, se fabricaron puntales cargados de células con micropatrones de superficie, utilizando C2C12 y células madre adiposas humanas (hASC) procesadas con una boquilla de plástico con ranuras en la superficie, para la regeneración del tejido muscular. Las construcciones celulares con un patrón de superficie ranurado uniaxialmente demostraron una diferenciación miógena mejorada debido a la alineación celular lograda por la combinación de la superficie ranurada en la boquilla y el proceso de reticulación asistido por fibra óptica in situ. Además, las construcciones de hASC bioimpresas se aplicaron en una lesión por defecto muscular volumétrico en ratones y demostraron una regeneración muscular significativamente mejorada en comparación con las fabricadas mediante un proceso de bioimpresión convencional.

En general, las biotintas fotorreticulables, como los hidrogeles metacrilados basados en gelatina, colágeno, ácido hialurónico y matriz extracelular descelularizada, se han utilizado ampliamente en la fabricación de construcciones cargadas de células debido a sus extraordinarias capacidades de encapsulación celular y propiedades mecánicas controlables que pueden lograrse de manera efectiva utilizando varios procesos de foto-entrecruzamiento9,19,20,21,22. Cuando las biotintas fotorreticulables se combinan con un proceso general de bioimpresión, se pueden fabricar con éxito construcciones multicapa cargadas de células con geometrías de poros personalizables. Sin embargo, la formación precisa y estable de construcciones celulares fabricadas mediante bioimpresión complementada con un proceso de fotoreticulación depende fundamentalmente del enfoque de reticulación empleado. De las diversas estrategias de reticulación que se combinan con la bioimpresión, la estrategia más innovadora es el "método de foto-reticulación in situ" ejecutado utilizando una boquilla de silicona hidrófoba transparente, que puede reducir la tensión de corte de una biotinta foto-reticulada que fluye8. Cuando la biotinta pasa a través de la boquilla, la luz ultravioleta se puede exponer directamente a la boquilla transparente para reticular la biotinta fotorreticulable y de baja viscosidad que fluye. Este método es de inmensa importancia porque entrecruza de manera efectiva y estable biotintas de baja viscosidad para lograr puntales cargados de células mecánicamente estables. Sin embargo, el proceso de fotoreticulación in situ requiere una boquilla fotopermeable transparente e hidrófoba especialmente diseñada. Además, debido a que la superficie de los puntales cargados de células puede reticularse más activamente que la región central de los puntales impresos, la propiedad adhesiva entre los puntales puede ser relativamente pobre después de fabricar estructuras celulares en 3D, lo que resulta en una baja capacidad de conformación estructural en 3D. .

Para superar las deficiencias de la reticulación in situ de biotintas fotorreticulables, desarrollamos un nuevo método de reticulación utilizando un proceso de bioimpresión 3D asistida por fibra óptica (OAB) que era completamente diferente a la bioimpresión convencional (CB) que utiliza un proceso de reticulación in situ ( Figuras 1a-c). Para evaluar el rendimiento del proceso de OAB, seleccionamos una biotinta foto-reticulable basada en Gelma cargada con mioblastos C2C12 con una densidad de 1 × 107 células / ml. Esto se debe a que Gelma puede considerarse una biotinta foto-reticulable típica con propiedades biocompatibles y biodegradables, y puede aplicarse ampliamente en estructuras de ingeniería de tejidos, sistemas de administración de fármacos y sustratos de curación de regiones de heridas23,24,25. Para reticular eficientemente la biotinta, se incrustó una fibra óptica en una boquilla de impresión general y, al controlar la intensidad de una fuente de luz UV (cabezal de punto UV, que se muestra en la Fig. 1d), pudimos obtener una imagen 3D mecánicamente estable y biológicamente segura. construcción cargada de células, como se presenta en las imágenes ópticas y vivas (verde) / muertas (rojas) en la Fig. 1a y la imagen óptica de la estructura de malla Gelma impresa (Fig. 1c). La Figura 1a, c presenta una imagen óptica de la luz ultravioleta observada a través de la fibra óptica insertada dentro de la boquilla. Además, para evitar un aumento de la temperatura de la biotinta debido a la fibra óptica, se colocó una camisa de agua de refrigeración (4 °C) alrededor de la boquilla de impresión (Fig. 1c, d). En comparación con la post-reticulación convencional, el proceso OAB propuesto puede obtener estructuras 3D cargadas de células con morfologías intrínsecas, como lo demuestran los valores de circularidad mejorados (Figura 1 complementaria). Además, el método OAB puede fabricar una estructura 3D multicapa realista en contraste con el CB, debido a una mayor adhesión entre puntales.

a Esquema de un proceso de bioimpresión asistida ópticamente (OAB) que utiliza una fibra óptica colocada dentro de una boquilla de una impresora e imágenes ópticas y vivas (verde)/muertas (rojas) del puntal Gelma impreso cargado de C2C12. b Esquemas de un hidrogel fotoreticulado dentro de una boquilla procesada con el proceso OAB y CB. c, d Sistema OAB conectado con una camisa de refrigeración por agua, una imagen de boquilla de impresión transversal y una imagen óptica de una estructura Gelma cargada de células de malla impresa.

Para observar el efecto del proceso OAB sobre la capacidad de fotoentrecruzamiento de la biotinta Gelma, se utilizó Gelma al 5% en peso. La Figura 2a ilustra el módulo de almacenamiento (G′) de la biotinta Gelma en el modo de barrido de tiempo antes y después de la exposición a los rayos UV (dosis de UV = 120 mJ/cm2 durante 10 s). Como era de esperar, la rigidez de Gelma expuesta a la luz ultravioleta mejoró significativamente después de la exposición a los rayos UV.

a Módulo de almacenamiento (G′) de Gelma al 5% en peso obtenido de pruebas de barrido de tiempo realizadas antes y después de la exposición a los rayos UV (dosis de UV = 120 mJ/cm2 durante 10 s). b Cambio de color en la mezcla de Gelma al 5% en peso y rojo fenol en varias dosis de UV. c Imágenes ópticas transversales de los puntales impresos de Gelma/rojo fenol fabricados mediante procesos convencionales de bioimpresión (CB) y OAB, la distribución del valor de gris utilizando las imágenes transversales para el radio y la diferencia del valor de gris en el centro y regiones marginales. d Imágenes ópticas de estructuras de malla Gelma impresas después de la impresión in situ, durante la agitación y después de la agitación para ilustrar la estabilidad estructural. e Prueba de corte de las estructuras de malla impresa procesadas con CB y OAB para observar las propiedades adhesivas entre los puntales. f Curvas tensión-deformación y módulo de Young de las estructuras Gelma impresas. Todos los datos se presentan como media ± DE. Los valores de p se calcularon mediante la prueba t de Student (n = 3/grupo; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Barra de escala, 200 µm (c); 1mm (d).

Para observar el efecto de la foto-reticulación producida por la fibra óptica colocada en el interior de la boquilla sobre la distribución de la reticulación sobre el área de la sección transversal de un puntal Gelma, medimos la distribución de la intensidad del color rojo del rojo fenol, que difería según el grado de foto-reticulación. La Figura 2b muestra las diversas intensidades de color rojo para la mezcla de 5% en peso de Gelma/rojo fenol (150 mg/L) a diferentes dosis de UV (0, 60 y 120 mJ/cm2), lo que indica que el color rojo se desvaneció. en blanco con una dosis de UV creciente. La Figura 2c ilustra dos imágenes transversales de puntales Gelma que se entrecruzaron mediante los procesos CB y OAB, respectivamente. En los procesos de impresión/reticulación, el tamaño de la boquilla de impresión, la velocidad de la boquilla, la presión neumática y la dosis de UV fueron 700 μm, 1 mm/s, 120 ± 10 kPa y 120 mJ/cm2, respectivamente.

La distribución del color rojo para los puntales de gelatina fotorreticulados fabricados utilizando los métodos CB y OAB se ilustra en la Fig. 2c. Como se indica en los resultados, la distribución transversal del color gris que ilustra el grado de fotoentrecruzamiento fue diferente para cada método. Para el proceso CB, la distribución relativa del color gris en la región de la sección transversal del puntal Gelma fue similar en el radio, mientras que para el puntal Gelma procesado con OAB, la foto-reticulación fue relativamente mayor en la región del núcleo que en la cubierta. región (el gráfico de la diferencia del valor de gris en la Fig. 2c). A partir de estos resultados, podemos esperar que el grado relativamente bajo de reticulación en la región de la carcasa del puntal pueda afectar la formación estructural 3D de filamentos impresos multicapa. La Figura 2d ilustra estructuras de malla impresa fabricadas utilizando los procesos CB y OAB (5% en peso de Gelma, dosis de UV = 120 mJ/cm2, tamaño de la boquilla = 700 μm, velocidad de movimiento de la boquilla = 2 mm/s y presión neumática = 120 ± 10 kPa ). Después de fabricar las estructuras Gelma, se agitaron las estructuras impresas. Como se muestra en las imágenes ópticas, la estructura de malla 3D se destruyó en los puntales Gelma fabricados mediante el proceso CB, mientras que la estructura de malla Gelma fabricada mediante el proceso OAB se mantuvo estable en su forma diseñada originalmente. Este resultado indica que los puntales de gelatina impresos mediante el proceso OAB se adhirieron bien entre sí para mantener la forma estructural 3D.

Para evaluar la fuerza adhesiva entre los puntales Gelma, medimos el desplazamiento versus la carga para la prueba de corte (Fig. 2e). En consecuencia, la energía adhesiva entre los puntales Gelma y la carga máxima de la fuerza interfacial entre los puntales Gelma fabricados mediante el proceso OAB fueron significativamente mayores que las de los puntales Gelma procesados mediante el proceso CB. Esto indicó que las formaciones estructurales 3D que consisten en puntales multicapa impresas con el proceso OAB se pueden obtener de manera mucho más eficiente que las impresas con el proceso CB. Sin embargo, para las curvas de tensión-deformación, la estructura procesada con CB exhibió un módulo de Young significativamente más alto que la estructura impresa con OAB (Fig. 2f). Creemos que la diferencia en el módulo de tracción podría haber resultado de los diferentes grados de homogeneidad de reticulación dentro de los puntales, como se muestra en la Fig. 2c. Para los puntales Gelma reticulados con el proceso OAB, la tensión de tracción aplicada externamente podría concentrarse altamente en la región reticulada relativamente baja de los puntales, induciendo una menor resistencia de la fuerza de tracción en comparación con la de los puntales Gelma reticulados homogéneamente procesados con CB.

Determinar el rango apropiado de parámetros de impresión (dosis de UV y temperatura de procesamiento) bajo una fracción de peso Gelma fija (5% en peso) y condiciones de impresión (tamaño de la boquilla = 700 μm, velocidad de movimiento de la boquilla = 1 mm/s y presión neumática = 120 ± 10 kPa), se realizó una prueba de línea única.

Primero, medimos las propiedades reológicas de la biotinta Gelma al 5% en peso durante barridos de temperatura y tiempo bajo varias dosis de UV (30, 90 y 150 mJ/cm2). Como se esperaba, la biotinta Gelma para el barrido de temperatura mostró un comportamiento típico de transición sol-gel (Fig. 3a). Además, el aumento de la dosis de UV a una temperatura constante (10 °C) mejoró el grado de reticulación de la biotinta Gelma (Fig. 3b).

Propiedades reológicas de Gelma al 5% en peso obtenidas mediante (a) barrido de temperatura y (b) barrido de tiempo a varias dosis de UV. c Diagrama de proceso que ilustra el efecto de la temperatura de procesamiento y la dosis de UV en el grado de reticulación de los puntales Gelma impresos (sin reticulación, reticulación insuficiente y reticulación estable). d Imágenes ópticas de la forma impresa de los puntales Gelma procesadas mediante OAB a varias dosis de UV (0, 90 y 120 mJ/cm2) e imágenes ópticas de los puntales impresos a los 7 días de cultivo. e Relaciones de hinchamiento del troquel (diámetro del puntal impreso/diámetro de la boquilla) para diversas dosis de UV. f Degradación de los puntales Gelma impresos determinada utilizando la diferencia de diámetro observada antes y después de 7 días de cultivo. Barra de escala, 1 mm (d—puntal); 500 µm (d-cultivado).

Para observar el efecto de la temperatura de la biotinta Gelma en el grado de fotoentrecruzamiento, seleccionamos tres temperaturas de procesamiento típicas: (1) región del gel: 10 °C, (2) región de transición gel-sol: 20 °C y ( 3) región solar: 30 °C para diversas dosis de UV (0–150 mJ/cm2). Para la temperatura de la región sol (30 °C), no se obtuvo una foto-reticulación estable del puntal Gelma impreso independientemente de la dosis de UV aplicada (0–150 mJ/cm2), mientras que para los puntales Gelma impresos en el gel y gel-sol A temperaturas de transición y con más de 60 mJ/cm2 de dosis de UV, se formaron puntales Gelma reticulados de manera estable (Fig. 3c). El grado de fotoentrecruzamiento para varias temperaturas sol-gel de la biotinta Gelma fue consistente con lo informado en el estudio realizado por Chansoria et al.26. Según su investigación, el módulo de compresión de la biotinta Gelma dependía en gran medida no sólo de las condiciones de exposición a los rayos UV sino también de la temperatura de fotoentrecruzamiento; el módulo aumentó a temperaturas de reticulación más bajas (temperatura del gel, 10 °C) de Gelma. Este resultado se obtuvo porque la foto-reticulación de la solución Gelma a baja temperatura podría inducir un efecto sinérgico de redes polipeptídicas estrechamente entrelazadas a bajas temperaturas y su foto-reticulación mediante unión covalente26.

Además, para demostrar la estabilidad estructural después de la foto-reticulación/impresión, medimos la relación de hinchamiento del troquel (D1/D0, donde D0 y D1 indican el diámetro de la boquilla interior y el diámetro del puntal en la punta de la boquilla, respectivamente) y la Cambio en el área de la sección transversal de los puntales Gelma después de 7 días en la solución de PBS. La Figura 3d y la Figura complementaria 2a muestran imágenes ópticas del puntal Gelma impreso cerca de la boquilla de impresión a una temperatura de impresión fija (10 °C) y varias dosis de UV (0–120 mJ/cm2). Debido al bajo grado de reticulación de Gelma expuesto a dosis de UV de 0 y 30 mJ/cm2, la relación de hinchamiento fue significativamente mayor que la del Gelma impreso reticulado a dosis de UV más altas (90 y 150 mJ/cm2) (Fig. 3e). . Además, la circularidad del puntal extruido aumentó significativamente hasta 120 mJ/cm2; sin embargo, el aumento adicional en la dosis de UV no afectó la circularidad (Figura complementaria 2b). Además, la velocidad del flujo (Figuras complementarias 2c, d) y la distancia de salida de la fibra óptica a la boquilla (Figuras complementarias 2e, f) se investigaron utilizando una dosis de UV fija (120 mJ/cm2). Como resultado, la velocidad del flujo tuvo efectos insignificantes sobre la circularidad de los puntales extruidos, mientras que el aumento de la distancia entre la fibra óptica y la boquilla había mejorado la circularidad. Se observó un resultado similar para el comportamiento de degradación (=[A0 − A1]/A0, donde A0 y A1 denotan las áreas de la sección transversal de los puntales impresos in situ y el área del puntal a los 7 días, respectivamente) de los puntales Gelma. (Figura 3f). Para dosis de UV inferiores a 90 mJ/cm2, la degradación de los puntales fue extremadamente rápida debido a grados de reticulación insuficientes. Según los resultados obtenidos utilizando la formación y las dimensiones de los puntales, pudimos seleccionar los ajustes adecuados para la dosis de UV (120 mJ/cm2).

Después de fijar la dosis de UV, investigamos varias temperaturas de la camisa de agua (4, 10 y 20 °C), como se muestra en las figuras complementarias 3a, b. Como resultado, la homogeneidad del puntal extruido medida usando la circularidad y la suavidad de la superficie mostró que el puntal procesado con la temperatura relativamente baja de la camisa de agua (4 °C) indicó una circularidad significativamente mayor y una superficie más suave en comparación con los de las otras temperaturas. Esto se puede atribuir a que la reticulación UV simultánea de Gelma a temperaturas más bajas puede inducir una estabilidad estructural expresiva27,28. Además, cuando la temperatura de la camisa de agua se establece en 4 °C, se midió que la temperatura de impresión era de 10 °C. Después de fijar la dosis de UV y la temperatura de impresión, se observó el efecto de la fracción en peso de Gelma sobre el grado de reticulación. La Figura complementaria 4a, b ilustra el módulo de almacenamiento para las tres fracciones de peso (3, 5 y 7% en peso) de la biotinta Gelma. Como se esperaba, las biotintas Gelma demostraron una transición sol-gel similar para el barrido de temperatura, y se logró la reticulación bajo una dosis fija de UV (120 mJ/cm2) y una temperatura de impresión (10 °C). Después de emplear las condiciones de procesamiento fijo y UV, registramos las imágenes ópticas y medimos la relación de hinchazón del troquel y la degradación de los puntales Gelma impresos mediante el proceso OAB (Figuras complementarias 4c-e). Para todas las concentraciones de biotinta Gelma, se observó una proporción de hinchazón del troquel de aproximadamente 1; sin embargo, se observó una reticulación insuficiente en la biotinta Gelma al 3% en peso (Figura complementaria 4e). Según los resultados, utilizamos una concentración de Gelma del 5% en peso y los siguientes parámetros de impresión: dosis de UV = 120 mJ/cm2 y temperatura de impresión = 10 °C para una evaluación adicional. Como se muestra en la figura complementaria 5, la dispersión de la luz ultravioleta dentro de la boquilla utilizando los parámetros establecidos puede provocar reticulación en la región central del puntal extruido, mientras que la región de la carcasa está relativamente menos reticulada. Con base en estos datos, predecimos cuidadosamente que los parámetros optimizados en el sistema OAB pueden permitir la fabricación de estructuras 3D multicapa.

Recientemente, los hidrogeles que cambian de forma o los sistemas de biofabricación 4D han estado ganando atención debido a que permiten la biomímesis y la formación de microarquitecturas intrincadas29,30,31. Para ampliar el proceso OAB a la fabricación 4D de varias arquitecturas biológicas complejas, conectamos dos fibras ópticas (fibra óptica-1 y fibra óptica-2) en una boquilla, como se muestra en la imagen esquemática de la Fig. 4a. En la imagen, cuando se encendió la fibra óptica-1, se puede lograr la foto-reticulación asimétrica de la estructura Gelma impresa. En general, una alta propiedad elástica (≈alto grado de reticulación) inducida en un bajo hinchamiento con agua32, de modo que el grado de reticulación asimétrica del hidrogel parece determinar la dirección de curvatura del hidrogel. La Figura 4b describe el mecanismo de curvatura en detalle, y la imagen óptica del puntal Gelma que se fabricó utilizando el proceso de foto-reticulación asimétrica puede indicar la reticulación asimétrica del puntal. Las Figuras 4c, d muestran la capacidad de curvatura de los puntales Gelma dependiendo del uso de las fibras ópticas. Cuando se expusieron al agua, los puntales Gelma fotorreticulados asimétricamente iniciaron diferentes tasas de hinchamiento, y se produjeron diversos comportamientos de hinchamiento en la dirección de la sección transversal del puntal debido al diferente grado de reticulación, formando estructuras en espiral y en forma de S. Basándonos en la prueba de concepto demostrada de la fabricación 4D, predecimos cuidadosamente que el sistema OAB se puede aplicar en diversas aplicaciones biológicas, como la formación de vasos sanguíneos o injertos nerviosos.

a Óptico y esquema de fotoentrecruzamiento asimétrico mediante dos fibras ópticas. b Mecanismo de transformación de forma del puntal Gelma y una imagen óptica del puntal Gelma fabricado. Capacidad de curvatura (formación de espiral c y curva d 's') de los puntales Gelma en función de la reticulación asimétrica de los puntales Gelma. Barra de escala, 100 µm (b); 5 mm (c,d).

Como se indicó en la sección anterior, una de las ventajas del proceso OAB es que las biotintas fotorreticulables se pueden reticular dentro de la boquilla, independientemente de la transparencia del material de la boquilla y la complejidad de la misma. Se utilizaron tres boquillas diferentes (boquilla de vidrio, boquilla de plástico opaco y boquilla de acero comprimido) para demostrar la viabilidad del proceso OAB, independientemente del diseño específico de la boquilla. Como se ilustra en la Fig. 5a, se usó una boquilla de vidrio para extruir la biotinta Gelma, y los puntales Gelma impresos con los procesos CB y OAB bajo las condiciones de impresión y UV previamente establecidas demostraron una forma cilíndrica completamente similar (Fig. 5b). Sin embargo, cuando se empleó el proceso OAB usando la boquilla de acero elipsoidal que se muestra en la Fig. 5c, se obtuvo un puntal Gelma con una forma que era más similar a la forma de la boquilla de sección transversal de acero que la forma del puntal impresa con el proceso CB. (Figuras 5c, d).

a Imágenes ópticas de superficie y transversales de los puntales Gelma impresos procesados mediante CB y OAB (dosis de UV = 120 mJ/cm2) yb circularidad de las imágenes transversales. c, d Una boquilla de acero con una forma de sección transversal elipsoidal, puntales Gelma impresos procesados mediante CB y OAB, y la relación de aspecto (longitud del eje largo (L1)/longitud del eje corto (L0) del puntal impreso) determinado utilizando las imágenes ópticas de la sección transversal de los puntales impresos. e Imágenes ópticas de tres boquillas de plástico con diferentes formas de sección transversal (N-1: redonda, N-2: más, N-3: estrella) y formas transversales impresas de Gelma fabricadas con cada boquilla de plástico y el proceso OAB. N-3-CB indica la imagen óptica de la sección transversal de Gelma procesada con la forma de boquilla de plástico N-3 pero reticulada mediante el proceso CB, no el proceso OAB. f Imágenes ópticas que muestran varias estructuras Gelma 3D usando la boquilla N-3 y el proceso OAB y (g) imágenes ópticas y de fluorescencia (colágeno: rojo y fibronectina: verde) de la superficie y los puntales transversales de Colma y dECM-ma fabricados usando el Boquilla plástica N-3 y proceso OAB. Todos los datos se presentan como media ± DE. Los valores de p se calcularon mediante la prueba t de Student (n = 3/grupo; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Barra de escala, 1 mm (a, boquilla c y puntal); 200 µm (a, c—sección transversal del puntal, e—SEM, g—fluorescencia y sección transversal); 500 µm (c, e—sección transversal de la boquilla, f—sección transversal, g—imágenes ópticas de la boquilla); 5 mm (f—vista lateral y vista superior).

Además, se utilizaron tres boquillas de plástico opaco con diferentes formas de sección transversal [redonda (N-1), en forma de plus (N-2) y en forma de estrella (N-3)] para imprimir la biotinta Gelma utilizando el OAB. proceso, como se muestra en la Fig. 5e. Las imágenes transversales de los puntales Gelma impresos con el proceso OAB exhiben formas similares a las de las boquillas de impresión, mientras que el puntal Gelma (N-3-CB) impreso con la boquilla N-3 y el proceso CB no presenta una forma. similar al de la boquilla de impresión (sección transversal en forma de estrella). Además, la figura complementaria 6 muestra imágenes ópticas del puntal Gelma impreso con boquillas N-2 y N-3 a varias dosis de UV (0–150 mJ/cm2). Para mostrar las formas 3D Gelma fabricadas utilizando el proceso OAB y la boquilla N-3, fabricamos las formas con tres estructuras diferentes, como se muestra en la Fig. 5f.

Para ampliar la viabilidad del proceso de OAB a diferentes hidrogeles metacrilados, se utilizó un colágeno metacrilato (Colma) (grado de metacrilación: 79,3 ± 1,6 %) y metacrilato dECM (dECM-ma, grado de metacrilación: 76,0 ± 2,4 %) que se derivó del esqueleto. Se utilizó tejido muscular. Se describió un esquema de los procesos de descelularización/metacrilación utilizando tejido muscular porcino (Figura complementaria 7a), y se mostraron los contenidos de ADN y colágeno, elastina y GAG para el tejido muscular, Colma y dECM-ma (Figura complementaria 7b-e). . La Figura 5g mostró las imágenes ópticas y de fluorescencia (colágeno: rojo, fibronectina: verde) de la superficie y de la sección transversal de los puntales impresos mediante el uso de la boquilla N-3 y el proceso OAB. El patrón de superficie microranurada se observó claramente en los puntales Colma y dECM-ma.

Al adoptar los siguientes parámetros de impresión: dosis de UV = 120 mJ/cm2, temperatura = 10 °C, presión de impresión = 120 ± 10 kPa, velocidad de movimiento de la boquilla = 1 mm/s, filamentos Gelma cargados de células (5 % en peso de Gelma, C2C12 densidad de 1 × 107 células / ml) se fabricaron utilizando los procesos CB y OAB-N-3 (forma de boquilla: N-3). Como se ilustra en la Fig. 6a, las imágenes ópticas de superficie y de sección transversal de los puntales Gelma cargados de células exhiben formas redondas y de estrella para los puntales procesados con CB y OAB-N-3, respectivamente. Las imágenes vivas (verde)/muertas (rojas) y la viabilidad celular (CB = 92,5 ± 2,2 % y OAB-N-3 = 91,9 ± 1,8 %) de los struts a 1 y 3 días de cultivo celular revelaron que los procesos, incluido cada procedimiento de fotoentrecruzamiento, eran seguros para las células cargadas (Fig. 6b, c).

a Superficie óptica e imágenes transversales de los puntales Gelma procesados mediante procesos CB y OAB con la boquilla N-3. b Vivos (verde)/muertos (rojo) a los 1 y 3 días de cultivo y (c) viabilidad celular para cada puntal de Gelma. d Proliferación celular determinada mediante el ensayo MTT para los puntales Gelma. e DAPI (azul)/faloidina (rojo) a los 14 días de cultivo y (f) DAPI/MHC (verde) a los 21 días de cultivo (el cuadro blanco indica la región ampliada). g Factor de orientación del MHC, índice positivo e índice de fusión para los puntales Gelma cargados de C2C12 a los 21 días de cultivo celular. h Expresión génica relativa de MHC y troponina T en estructuras CB y OAB-N-3 a los 14 y 21 días de cultivo celular. Todos los datos se presentan como media ± DE. Los valores de p se calcularon mediante la prueba t de Student (n = 5/grupo; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Barra de escala, 500 µm (a—superficie, e, f—panel superior); 200 µm (a—sección transversal, b); 100 µm (e, f—panel inferior).

Además, medimos la proliferación celular utilizando el ensayo MTT para los struts y descubrimos que la tasa de proliferación no era significativamente diferente entre los struts. Para observar la morfología celular de los puntales Gelma, se capturaron imágenes DAPI (azul)/faloidina (rojo) después de 14 días de cultivo celular. En las imágenes grabadas, se observó actina F alineada uniaxialmente en el puntal Gelma con un patrón de superficie ranurado fabricado usando el proceso OAB-N-3, mientras que en el puntal impreso con el proceso CB, se observó una alineación uniaxial similar de actina F. no logrado (Fig. 6e). Además, las imágenes DAPI/MHC (verde) a los 21 días de cultivo celular mostraron MHC bien alineados y acelerados, determinado por el factor de orientación (=[90 − φ]/90, donde φ = ancho completo a la mitad del máximo en una distribución de alineación ), y se observaron valores de índice/índice de fusión más positivos en los puntales Gelma procesados con OAB-N-3 que en los puntales procesados con CB (Fig. 6f, g).

Para observar la diferenciación miogénica de los puntales Gelma impresos, se observó la expresión de genes miogénicos (MHC y troponina T) a los 14 y 21 días de cultivo celular (Fig. 6h). Los genes miogénicos estaban regulados positivamente en el grupo Gelma procesado con OAB-N-3; Esto se debió a la señal topográfica (forma de ranura) dentro de la boquilla, que fue especialmente diseñada para inducir la alineación de las células. Estos resultados concuerdan con los resultados de varios estudios que han demostrado que varios andamios con patrones topográficos uniaxiales pueden ajustar la alineación de los mioblastos e incluso la formación de miotubos33,34,35. En este documento, se utilizaron células C2C12 inmortalizadas para evaluar las actividades celulares in vitro. Sin embargo, los resultados in vitro pueden diferir cuando se utilizan células primarias autólogas o alogénicas.

Los puntales Gelma cargados de hASC fabricados utilizando los procesos CB, OAB-N-1 (forma de boquilla: N-1) y OAB-N-3 (forma de boquilla: N-3) se aplicaron a la regeneración de tejido VML, que se obtuvo extirpando el 40% de un músculo TA original en un modelo de ratón36. En este análisis, utilizamos hASC para apoyar la regeneración de VML defectuosa37,38 porque la diferenciación de hASC en varios linajes celulares, incluido un linaje miógeno, puede ser inducida por diversos estímulos químicos y físicos39. Como se ilustra en la Fig. 7a, las construcciones de Gelma cargadas de hASC fabricadas (densidad celular = 1 × 107 células/ml, tamaño = 2 × 4 × 1,6 mm3) (CB, OAB-N-1 y OAB-N-3) se aplicaron en la región muscular defectuosa. Como se esperaba, las hASC estaban vivas en las tres estructuras y las células cargadas en el grupo OAB-N-3 estaban bien alineadas en la dirección de impresión en comparación con las de CB y OAB-N-1 (Fig. 7a-c).

a Imágenes ópticas, vivo/muerto en los días 1 y 3, e imágenes DAPI/faloidina en los días 7 y 14 de construcciones musculares CB y OAB (OAB-N-1 y OAB-N-3) cargadas con células madre de tejido adiposo humano procesadas con Boquillas N-1 y N-3, respectivamente. b Viabilidad celular de las construcciones musculares a los 1 y 3 días de cultivo celular (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra) y (c) factor de orientación usando actina F a los 14 días de cultivo celular (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra). d Aspecto macroscópico de las construcciones implantadas en el defecto del músculo TA. Se cuantificó (e) fuerza de agarre, (f) prueba de latencia a la caída y (g) peso muscular después de 4 semanas de implantación (n = 5 por animal, tres mediciones repetidas por muestra). h H&E (púrpura: núcleos, rosa: citoplasma), MT (rojo: fibra muscular, azul: colágeno) y DAPI/MHC (verde) de los sitios trasplantados, (i) área fibrótica (%) (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra), (j) miofibras nucleadas centralmente (%) (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra), (k) área de miofibras nucleadas periféricamente (%) (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra), (l) diámetro de las miofibras (μm) (n = 25 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra) y (m) área positiva para MHC (%) (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra) para muestras simuladas, solo con defectos, CB, OAB-N-1 y OAB-N-3. Todos los datos se presentan como media ± DE. Los valores de p se calcularon mediante la prueba t de Student (b, c) y ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey (e–m) (no significancia estadística NS, *p < 0,05; **p < 0,01; *** p<0,001). Barra de escala, 2 mm (a—óptica, d); 500 µm (a—vivo/muerto, h–H&E); 100 µm (a—DAPI/faloidina); 50 µm (h—H&E magnificada, MT, DAPI/MHC).

Para evaluar la eficiencia de la regeneración muscular de VML, se formaron cinco grupos: (1) simulado (sin defecto), (2) solo defecto, (3) CB, (4) OAB-N-1 y (5) OAB-N-3. El grupo se implantó en el modelo de ratón (Fig. 7d). La evaluación de la fuerza de agarre y la latencia a la caída es una evaluación confiable de la eficacia regenerativa muscular14,40,41,42. Como tal, los resultados de la prueba de fuerza de agarre y la prueba de latencia de caída en ratones 4 semanas después de la implantación de las construcciones se muestran en las figuras 7e-g. El grupo OAB-N-3 mostró una fuerza de agarre significativamente mayor que los otros grupos, y una fuerza de agarre similar a la del simulacro (Fig. 7e). Sin embargo, el tiempo de latencia de caída mostró una latencia de caída relativamente más larga en comparación con los otros grupos, pero fue significativamente menor que la del grupo simulado (Fig. 7f). Atribuimos estos hallazgos a la denervación de las fibras musculares después del defecto VML, lo que resulta en un deterioro funcional42,43,44. Para evaluar este efecto, las secciones de músculo extraídas se tiñeron con receptores de acetilcolina (AchR) (Figura complementaria 8a). Se observaron expresiones significativamente más altas de AchR en los ratones que recibieron OAB-N-3 en comparación con otros grupos (Figura complementaria 8b). Además, el peso muscular del grupo OAB-N-3 fue muy similar al del grupo simulado (Fig. 7g). La Figura 7h ilustra los resultados histológicos longitudinales de H&E, tinción con MT y DAPI/MHC, y la Figura complementaria 9 muestra la tinción con H&E en sección transversal. Se midieron las áreas fibróticas, las miofibras nucleadas centralmente, el área de miofibras nucleadas periféricamente, el diámetro de las miofibras y el área positiva para MHC, y los resultados se presentan en las figuras 7i-m. Como se ilustra en los resultados, se detectó una regeneración muscular más eficiente y un bajo grado de fibrosis (área azul en la tinción MT) en el grupo OAB-N-3 en comparación con los valores correspondientes en los grupos CB y OAB-N-1, lo que demuestra que las señales topográficas, causadas por la ranura de la boquilla utilizada en el proceso OAB-N-3. Además, las fibras musculares con núcleo central en las secciones musculares extraídas de los ratones que fueron procesados con OAB-N-3 eran considerablemente más bajas en comparación con las de defecto, CB y OAB-N-142,45,46. Con base en estos resultados, predecimos cuidadosamente que el bioconstructo OAB-N-3 puede inducir una regeneración muscular más efectiva que la de los grupos CB y OAB-N-1 sin ninguna señal topográfica.

Más interesante aún, las miofibras formadas en las construcciones implantadas se originaron a partir de las hASC impresas en CB, OAB-N-1 y OAB-N-3, respectivamente, como se confirma mediante inmunofluorescencia doble para MHC/MRPL11 y MHC/HLA-A. a las 4 semanas después de la implantación (Fig. 8a). En particular, se puede observar que el grupo OAB-N-3 tiene fibras musculares positivas para MRPL11 y HLA-A significativamente más altas que otros grupos (CB y OAB-N-1) (Fig. 8b, c). Con base en los resultados histológicos, podemos concluir que la regeneración muscular usando la construcción Gelma cargada de células procesada usando el proceso OAB-N-3 puede acelerarse en comparación con la que usa la construcción Gelma procesada usando el proceso CB y OAB-N-1. Sin embargo, a pesar de estos resultados regenerativos musculares favorables con respecto a la construcción propuesta (OAB-N-3), vale la pena señalar que debido a los pequeños tamaños de los defectos del modelo VML de ratón, falta relevancia clínica.

a Imágenes de inmunofluorescencia doble de DAPI (azul)/MHC (rojo)/MRPL 11 (verde) y DAPI (azul)/MHC (rojo)/HLA-A (verde). Se cuantificaron (b) MRPL11 y (c) miofibra positiva HLA-A (%) (n = 5 por grupo, cuatro campos aleatorios en cada muestra). Todos los datos se presentan como media ± DE. Los valores de p se calcularon mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey (NS = no significancia estadística, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Barra de escala, 200 µm (a—DAPI/MHC/MRPL11); 50 µm (a-DAPI/MRPL11, DAPI/HLA-A); 100 µm (a—DAPI/MHC/HLA-A).

En este estudio, desarrollamos un novedoso proceso de bioimpresión complementado con un método de fotoentrecruzamiento asistido por fibra óptica para fabricar filamentos cargados de células con superficies micropatrones para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Para obtener puntales cargados de células biofuncionales con una señal topográfica, se seleccionaron cuidadosamente los parámetros de impresión apropiados, como la dosis de UV y la temperatura de impresión. Para demostrar la viabilidad del proceso de bioimpresión, se utilizaron mioblastos C2C12 y hASC para observar actividades miogénicas in vitro y defectos musculares volumétricos in vivo, respectivamente, en un modelo de ratón. Como resultado del fenotipo biomimético en las construcciones Gelma cargadas de células procesadas con OAB-N-3, se observó una mejor reparación de VML in vivo en comparación con las bioconstrucciones impresas mediante procesos de impresión convencionales. Con base en estos resultados, creemos que el proceso de bioimpresión recientemente diseñado combinado con reticulación asistida por fibra óptica puede servir como un enfoque prometedor para fabricar construcciones biofuncionales cargadas de células para su aplicación en diversas regeneraciones de tejidos.

El sistema de bioimpresión asistido por fibra óptica estaba compuesto por tres partes principales: una impresora 3D (DTR3-2210 T-SG; DASA Robot, Corea), un generador ultravioleta (UV) con un cabezal de punto UV (LGA-20562; Liim Tech, Corea) y una boquilla combinada con una fibra óptica, como se presenta en las figuras 1a-c. Se adquirieron fibras ópticas de sílice (diámetro = 200 μm, longitud = 5,5 cm, apertura numérica = 0,22, Edmund Optics, Nueva Jersey, EE. UU.) con baja atenuación a la radiación UV (40 db/km) de Edmund Optics (Barrington, Nueva Jersey, EE. UU.) . Las boquillas de plástico se fabricaron utilizando una impresora 3D de procesamiento de luz digital (X-CUBE3, Foshan Stek Technology, China) con resina de acrilato fotocurable (3DV-301; WOW 3D, Corea del Sur). Después de la impresión, las boquillas se lavaron con etanol y se secaron a temperatura ambiente. A continuación se insertó la fibra óptica en las boquillas de plástico.

La metacrilación de gelatina se realizó como se informó anteriormente47. Brevemente, la gelatina (10% en peso; 300 g de Bloom; Sigma-Aldrich) obtenida de piel porcina se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se añadió gota a gota anhídrido metacrílico (Sigma-Aldrich, EE. UU.) a 50 °C y la solución se agitó a 500 rpm durante 3 h. Gelma se dializó en agua destilada utilizando una membrana de diálisis con corte de peso molecular de 12 kDa (Thermo-Fisher Scientific, EE. UU.) a 40 °C durante 7 días para eliminar el anhídrido metacrílico restante. Finalmente, Gelma fue liofilizado y almacenado en un congelador.

La solución de Gelma (5% en peso) se disolvió en PBS que contenía fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (0,05% en peso; Sigma-Aldrich, EE. UU.) a 37 °C. Para esterilizar los hidrogeles Gelma se utilizaron filtros de jeringa de 0,22 μm (Thermo-Fisher Scientific, EE. UU.). Se obtuvieron dos biotintas Gelma diferentes mezclándolas con mioblastos de ratón C2C12 (CRL-1772; ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) y hASC (PT-5006; Lonza, Basilea, Suiza) a una densidad de 1 × 107 células/ml.

Se utilizó un reómetro rotacional Bohlin Gemini HR Nano (Malvern Instruments, Reino Unido) equipado con una geometría de placa paralela acrílica (diámetro = 40 mm y espacio = 200 μm) para evaluar las propiedades reológicas de las biotintas Gelma. Se realizó una prueba de barrido de tiempo (deformación = 1%; temperatura = 10 °C; y frecuencia = 1 Hz) de la biotinta Gelma en diversas condiciones de UV. Se realizó una prueba de barrido de temperatura (4–45 °C) de la solución Gelma a una velocidad creciente (5 °C/min) con una frecuencia fija de 1 Hz y una deformación del 1 %.

Para fabricar las construcciones cargadas de células se utilizó una boquilla de fibra óptica, junto con un sistema de impresión de tres ejes (DTR3-2210 T-SG; DASA Robot, Corea) y un sistema de dispensación (AD-3000C; Ugin-tech, Corea). . Los parámetros del proceso fueron los siguientes: velocidad de movimiento de la boquilla = 2 mm/s, caudal de biotinta = 0,045 ml/min, temperatura del barril = 10 °C y temperatura de la camisa de agua = 4 °C. Durante el proceso de extrusión, la biotinta se expuso simultáneamente a una dosis de UV [(dosis = Iv × t; Iv = intensidad de UV (20 mW/cm2), t = tiempo de exposición a UV (6 s)] de 120 mJ/cm2 para la reticulación. La intensidad UV se midió usando un fotómetro UV (LS125; Linshang, China).

La caracterización morfológica se realizó utilizando un microscopio óptico (BX FM-32; Olympus, Tokio, Japón) equipado con una cámara digital y un microscopio electrónico de barrido (SNE-3000M; SEC, Inc., Corea del Sur). Se utilizó el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU.) para detectar diferencias entre los valores de grises de la sección transversal, la circularidad (=4π × A/P2, donde A = área y P = perímetro) y la relación de aspecto determinada. por la longitud más larga/longitud más corta. La tasa de biodegradabilidad se evaluó sumergiendo las muestras en PBS a 37 °C durante 7 días. Se consideraron las diferencias en los cambios del diámetro de los puntales para medir la tasa de degradación.

Los análisis mecánicos, incluidas las pruebas de tracción y corte de las estructuras, se realizaron utilizando una máquina de tracción universal (Toptech 2000; Chemilab, Corea). Para medir las propiedades de tracción, las muestras (10 × 3 × 1,6 mm3) se probaron a una velocidad de 0,5 mm/s utilizando una celda de carga de 30 kgf. Para calcular las propiedades de adhesión entre las construcciones impresas (10 mm × 25 × 1,6 mm3), la prueba de corte se basó en ASTM F2255-0548 con una velocidad de estiramiento de 0,5 mm/s.

Para la evaluación in vitro, se bioimprimieron construcciones cargadas de células (mioblastos C2C12 o hASC) con densidades celulares de 1 × 107 células/ml y dimensiones de 6 × 30 × 1,6 mm3. Las construcciones cargadas de C2C12 se cultivaron en placas de cultivo de tejidos de seis pocillos con medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa que contenía 1% de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep, Thermo-Fisher Scientific, EE. UU.) y 10% de suero bovino fetal ( FBS, Gemini Bio-Products, EE.UU.). Además, utilizamos DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con suero de caballo al 2% (Sigma-Aldrich St Louis, EE. UU.) para inducir la miogénesis. Las construcciones cargadas de hASC se cultivaron en placas de cultivo de tejidos de seis pocillos con DMEM bajo en glucosa que contenía 1% de Pen-Strep y 10% de FBS. Además, utilizamos un suplemento DMEM bajo en glucosa que contenía 5% de suero de caballo, dexametasona 0,1 μM e hidrocortisona 50 μM. El medio para todas las muestras se cambió cada 3 días.

La viabilidad celular dentro de las construcciones cargadas de células se investigó utilizando un kit de ensayo vivo/muerto (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las construcciones cargadas de células se recogieron después de 1 día de cultivo, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) y se incubaron en una solución reactiva (calceína AM 0,15 mM/ml y homodímero-1 de etidio 2 mM en DPBS) a temperatura ambiente durante 40 min para el ensayo vivo/muerto. Se capturaron tres imágenes de las muestras teñidas utilizando un microscopio confocal (LSM 700; Carl Zeiss, Alemania) después de un lavado suave con DPBS. Usando estas imágenes, cuantificamos el valor medio de la viabilidad celular (%) como la proporción de células vivas con respecto al total de células contando el número de células vivas (verde) y células muertas (rojo) utilizando el software ImageJ.

La actividad metabólica celular dentro de la construcción se midió usando un kit de ensayo de bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difenil tetrazolio (MTT) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). Después de 1, 3 y 7 días de cultivo, se midió la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial en células vivas a una absorbancia de 570 nm después de la exposición a 0,5 mg/ml de la solución de MTT a 37 °C durante 4 h. Los valores de absorbancia obtenidos de construcciones libres de células se restaron de los obtenidos de construcciones cargadas de células.

Las construcciones bioimpresas que contenían mioblastos C2C12 y hASC se fijaron en 3,7 % de paraformaldehído (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos, se bloquearon utilizando un agente bloqueador de proteínas sin suero (Agilent) durante 1 h y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1 % ( Sigma-Aldrich) durante 3 min. El citoesqueleto de las células en las construcciones bioimpresas se visualizó mediante inmunofluorescencia usando faloidina conjugada con Alexa Fluor 594 (rojo; 1:100 en DPBS; Invitrogen), y los núcleos se tiñeron con diamidino-2-fenilinodol (DAPI) (azul; 1:100 en DPBS; Invitrogen). El factor de orientación [=(90° − φ)/90°, φ = ancho total a la mitad del máximo (FWHM)] se analizó utilizando el software ImageJ.

Para la inmunofluorescencia de la cadena pesada de miosina (MHC), las construcciones bioimpresas se trataron con un anticuerpo primario anti-MF20 (5 μg/ml; Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA, EE. UU.) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Luego, las muestras se lavaron con DPBS y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 (verde; 1:50 en DPBS; Invitrogen) durante 1 h. Finalmente, los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes inmunofluorescentes de MHC/DAPI se visualizaron y capturaron utilizando un microscopio confocal, y la madurez de las miofibras (índice positivo de MHC e índice de fusión) se cuantificó utilizando el software ImageJ.

Para el análisis cuantitativo en tiempo real de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (qRT-PCR), las construcciones bioimpresas se recolectaron después de 14 y 21 días de cultivo, y se utilizaron marcadores de genes miogénicos MHC y troponina T. Brevemente, las construcciones cargadas de células se trataron con un reactivo TRIzol (Sigma-Aldrich) para aislar el ARN. La concentración y pureza del ARN se midieron utilizando un espectrofotómetro (FLX800T; BioTeK, EE. UU.). Las muestras de ARN se trataron con ADNasa libre de ARNasa antes de la síntesis de ADNc. Las muestras de ADNc se sintetizaron utilizando Power SYBRVR Green qPCR Master Mix (Qiagen). Se utilizó un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems, EE. UU.) para realizar el análisis de RT-PCR, según el protocolo del fabricante. Para la normalización se utilizó el gen de mantenimiento gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Las secuencias de cebadores específicos para los genes diana se enumeran en la Tabla 1.

Los defectos del músculo TA se crearon en ratones C57BL/6 (machos, 10 semanas de edad, DooYeol Biotech, Inc., Seúl, Corea), y todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité Asesor Institucional de Investigación y Cuidado de Animales de la Centro de Investigación con Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sungkyunkwan y cumplió con las regulaciones del Comité de Ética Institucional (SKKUIACUC2021-08-11-2). Brevemente, los ratones se dividieron aleatoriamente en cinco grupos (un total de 25 ratones, n = 5 por grupo). Antes de la implantación, los ratones fueron anestesiados primero con isoflurano al 3% v/v y sus músculos se aislaron de la fascia mediante una incisión en la piel debajo de las piernas izquierda y derecha. Después de esto, se extirparon el extensor largo de los dedos y el extensor largo del dedo gordo para inducir una lesión por pérdida muscular volumétrica (VML), y aproximadamente el 40% de los músculos TA se extirparon y pesaron (Tabla complementaria 1). Para la restauración de VML, se trasplantaron construcciones bioimpresas cargadas de hASC (2 × 4 × 1,6 mm3) en regiones de defectos del músculo TA y se cubrieron con fascia y piel suturadas. Después de la implantación, los ratones recibieron una inyección subcutánea de 0,5 mg/kg de buprenorfina para controlar el dolor y se les dio comida y agua normalmente después de la operación. Después de 4 semanas de implantación, los ratones fueron sacrificados mediante inhalación de CO2 y dislocación cervical secundaria. Antes del trasplante, las construcciones cargadas de hASC se cultivaron en un medio de crecimiento durante 1 día para estabilizar las células31,49.

La funcionalidad del músculo esquelético de ratones que recibieron diversos tratamientos se evaluó midiendo la fuerza de agarre y la latencia para caer. La fuerza de agarre máxima de los ratones a las 4 semanas después del trasplante se midió tirando del ratón paralelo a la línea de la cuadrícula y midiendo la fuerza de agarre (medidor de fuerza de agarre, BIO-G53, BIOSEB, FL, EE. UU.)) como el procedimiento descrito50. Además, la latencia de caída se evaluó midiendo el tiempo transcurrido después de colocar el ratón sobre una varilla. El período de latencia máximo se fijó en 300 s. Cada experimento se repitió tres veces por ratón. Se proporcionó un intervalo de duración de 5 minutos entre las repeticiones (n = 5 por animal, tres mediciones repetidas por muestra).

Para la tinción histológica, las muestras de músculo TA recolectadas se fijaron con formalina tamponada neutra al 10% durante 24 h. Luego, las muestras se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se seccionaron en rodajas de cinco micrones de espesor. Las secciones de músculo se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y tricrómico de Masson (MT). Las imágenes teñidas con H&E y las imágenes teñidas con MT fueron analizadas por el software ImageJ para cuantificar las miofibras nucleadas centralmente, el área de miofibras nucleadas periféricamente y el área fibrótica respectivamente (n = 5 por muestra, cuatro campos aleatorios en cada muestra). Las miofibras nucleadas centralmente y las fibras musculares nucleadas periféricamente se cuentan manualmente utilizando la herramienta multipunto en imageJ. La miofibra con núcleo central se obtuvo dividiendo el número de miofibras con núcleo central entre el número total de fibras musculares. Además, el área de miofibras nucleadas periféricamente se calculó dividiendo el área de miofibras nucleadas periféricamente entre el área total de fibras musculares.

Para la tinción por inmunofluorescencia, las muestras seccionadas se trataron con un anticuerpo primario anti-MF20 (5 μg/ml; Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA), anti-MRPL11 (proteína ribosomal antimitocondrial policlonal de conejo L11, reactividad de especie: humana, 1 :dilución 100; Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-HLA-A (reactividad de especie: humana, dilución 1:100; Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-CHRNB2 (subunidad beta-2 del receptor neuronal de acetilcolina, dilución 1:100 , Thermo-Fisher Scientific, EE. UU.) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Luego, las muestras se lavaron con DPBS y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 (verde; 1:50 en DPBS; Invitrogen) o anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 594 (rojo; 1:50 en DPBS; Invitrogen) y Alexa 488- IgG anti-conejo conjugada (dilución 1:200, Invitrogen) durante 1 h. Finalmente, los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes de inmunofluorescencia MHC/DAPI se capturaron utilizando un microscopio confocal. El área de fibra muscular por campo (%) (n = 5 por muestra, cuatro campos aleatorios en cada muestra), el diámetro de las miofibras (n = 25 por muestra, cuatro campos aleatorios en cada muestra) y el área positiva para MHC (% ) (n = 5 por muestra, cuatro campos aleatorios en cada muestra) se midieron con imágenes inmunofluorescentes para MHC/DAPI (aumento ×400) de forma ciega. El área de miofibras positivas para MRPL11 y HLA-A (%) se midió con imágenes de inmunofluorescencia doble para MHC/MRPL11 y MHC/HLA-A (aumento de ×400) de forma ciega (n = 5 por muestra, cuatro campos aleatorios en cada muestra). Todas las imágenes de muestra se cuantificaron utilizando el software ImageJ. Todos los valores se presentan como media ± desviación estándar.

Se utilizó el software SPSS (SPSS, Inc., EE. UU.) para realizar los análisis estadísticos. Las comparaciones de dos grupos se evaluaron mediante la prueba t, y se compararon tres o más grupos mediante la evaluación del análisis de varianza unidireccional o bidireccional (ANOVA) con la prueba post hoc HSD de Tukey. Se consideraron estadísticamente significativos los valores de *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Este estudio fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Ciencia y TIC para el Proyecto de Desarrollo de Tecnología de Innovación Bioinspirada (NRF-2018M3C1B7021997 y NRF-2021R1A5A8029876 a DR) y el Programa de Investigación en Ciencias Básicas (NRF-2021R1I1A1A01061021) . Este estudio también fue apoyado por una subvención del Ministerio de Comercio, Industria y Energía (MOTIE, Corea) en el marco del Programa de Innovación en Tecnología Industrial (20009652: Tecnología sobre comercialización y materiales de hidroxiapatita bioabsorbible de tamaño inferior a un micrómetro).

Estos autores contribuyeron igualmente: JaeYoon Lee, Hyeongjin Lee.

Departamento de Medicina de Precisión, Facultad de Medicina de la Universidad Sungkyunkwan, Suwon, República de Corea

JaeYoon Lee, Hyeongjin Lee y Geun Hyung Kim

Departamento de Biotecnología y Bioinformática, Universidad de Corea, Sejong, República de Corea

Hyeongjin Lee

Departamento de Biología Celular Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad Sungkyunkwan, Suwon, República de Corea

Eun-Ju Jin y Dongrieol Ryu

Departamento de Ciencia e Ingeniería Biomédicas, Instituto de Ciencia y Tecnología de Gwangju, Gwangju, República de Corea

Dongryeol Ryu

Departamento de Biofísica, Instituto de Biofísica Cuántica, Universidad Sungkyunkwan, Suwon, República de Corea

Geun Hyung Kim

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Correspondencia a Dongryeol Ryu o Geun Hyung Kim.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Lee, J., Lee, H., Jin, EJ. et al. Bioimpresión 3D utilizando un nuevo método de fotoreticulación para la restauración del tejido muscular. npj Regen Med 8, 18 (2023). https://doi.org/10.1038/s41536-023-00292-5

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Recibido: 02 de julio de 2022

Aceptado: 17 de marzo de 2023

Publicado: 31 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41536-023-00292-5

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